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本方案參照2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中禁用組分檢驗方法2.4第二法：高效液相色譜-紫外檢測器/熒光檢測器法，該法適用于化妝品中雌三醇等7種組分含量的測定。

一、方法原理

樣品提取后，經(jīng)高效液相色譜儀分離，紫外檢測器檢測，以保留時間定性，峰面積定量。

二、儀器和試劑

a. 高效液相色譜儀（上海儀電分析儀器有限公司LC220）：配備紫外檢測器；

b. 自動進樣器（上海儀電分析儀器有限公司AS2000）；

c. 色譜柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，粒徑為5 μm，或其他等效色譜柱；

d. 分析天平：感量為0.0001g；

e. 離心機：轉(zhuǎn)速>3000r/min；

f. 超聲波發(fā)生器；

g. 一般實驗室常用儀器。

h. 甲醇；

i 飽和氯化鈉溶液；

j. 環(huán)己烷；

k. 硫酸[j(H2SO4)＝2%]：

取硫酸（r20＝1.84g/mL）2mL，緩慢加入到98mL水中，混勻。

三、實驗方法

3.1 標準系列的制備

3.1.1 **標準溶液（或直接購買混標）

雌**標準溶液：分別稱取雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚各0.2g（精確到0.0001g），用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度。

雄**標準溶液：分別稱取睪丸酮、甲基睪丸酮各0.6g（精確到0.0001g），用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，配制成含睪丸酮、甲基睪丸酮為6.00mg/mL的溶液。取此溶液 10.0mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度。

孕**標準溶液：稱取黃體酮 0.6g（精確到 0.0001g），用少量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，配制成含孕**6.00mg/mL的溶液。取此溶液 10.0mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度。

混合標準儲備溶液：分別取雌**標準溶液50.00mL，雄**標準溶液5.00mL和孕**標準溶液5.00mL置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，配制成1mL分別含4種雌**各1.00mg、2種雄**各30.0μg和1種孕**30.0μg的混合標準儲備溶液。

3.1.2 混合標準系列溶液的制備

取混合標準儲備溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL于10mL具塞比色管中，用甲醇稀釋至10mL刻度，制得混合標準系列溶液。

3.2 樣品處理

溶液狀樣品：稱取樣品 1-2g（精確到0.001g）于10mL具塞比色管中，在水浴上蒸除乙醇等揮發(fā)性有機溶劑，用甲醇稀釋到10mL，作為樣品待測溶液。

膏狀、乳狀樣品：稱取樣品 1-2g（精確到 0.001g）于100mL錐形瓶中，加入飽和氯化鈉溶液50mL，硫酸2mL，振蕩溶解，轉(zhuǎn)移至100mL分液漏斗中，以環(huán)己烷30mL分三次萃取，必要時離心分離。合并環(huán)己烷層并在水浴上蒸除。用甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到 10mL具塞比色管中，用甲醇稀釋到刻度。混勻后，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液作為樣品待測溶液。

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